异戊烯基黄酮（prenylated flavonoids）是植物中广泛存在的一类重要活性天然产物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性。异戊烯基转移酶（prenyltransferases, PTs）是负责催化异戊烯基供体（如DMAPP）与黄酮骨架偶联的生物合成关键酶。尽管自然界中已报道约30个植物黄酮PT，但普遍存在底物谱窄、催化效率低、修饰位点有限等问题，制约了异戊烯基黄酮的生物合成应用。胀果甘草（Glycyrrhiza inflata）异戊烯基取代黄酮结构独特且类型丰富，但其生物合成异戊烯基转移酶尚无一例报道。
2026年4月29日，北京大学药学院、北京大学-云南白药国际医学研究中心叶敏教授/王子龙副研究员团队于ACS Catalysis发表题为《Discovery and engineering of prenyltransferases in Glycyrrhiza inflata enable diversified biosynthesis of prenylated flavonoids》的研究论文。该研究从胀果甘草中鉴定出6个功能各异的黄酮异戊烯基转移酶（含3个C6-和3个C3¢-PT，识别不同结构类型底物），通过蛋白质工程获得了底物谱最广的植物PT突变体GinPT5-M171I，可实现39种异戊烯基酚类化合物的酶法合成。
异戊烯基转移酶的鉴定与功能验证
首先对胀果甘草不同部位进行LC-MS分析，发现根及叶中均富含C6-或C3¢-异戊烯基黄酮。为鉴定负责C3¢和C6位异戊烯基化的PT，作者利用基于基因表达量和进化树分析的基因筛选策略，共挖掘到12条候选基因进行活性验证（图1）。
图1.生物信息学分析获取异戊烯基转移酶候选基因。
图2. 胀果甘草异戊烯基转移酶的功能表征。
通过体外功能鉴定，最终鉴定出6个新的黄酮PT，分别命名为GinPT1-GinPT6。根据区域选择性，它们可被分为两组：GinPT1、GinPT2、GinPT5催化黄酮类底物A环C6位异戊烯基化；GinPT3、GinPT4、GinPT6催化B环C3'位异戊烯基化（图2）。其中，GinPT6是首个特异性催化黄酮C3'位异戊烯基化的植物PT。底物谱分析显示，6个PT对11个黄酮类底物表现出不同的偏好（图3）。GinPT1底物谱较宽，能接受查耳酮、异黄酮和黄酮；GinPT2和GinPT3专一性催化查耳酮；GinPT4偏好异黄酮；GinPT6可接受黄酮和黄酮醇；值得注意的是，GinPT5虽与GinPT1有89%序列相似性，GinPT1底物识别能力显著高于GinPT5。
图3. GinPT1-GinPT6底物选择性考察。
理性设计提升GinPT5的底物广谱性与催化效率
为揭示GinPT1与GinPT5底物识别差异的关键氨基酸，对两者的底物结合口袋进行比较分析，发现两个关键差异氨基酸残基：GinPT5的M171（对应GinPT1的I167）和F394（对应Y390）。分别构建GinPT5的单点突变体M171I和F394Y。以芹菜素（2）和异甘草素（6）为底物测试，M171I突变体的转化率均超过95%，远高于野生型。酶动力学分析表明，M171I对底物的Km值显著降低，底物亲和力提高。
图4. GinPT5的理性设计改造。
进一步以32个结构多样的酚类化合物（包括查耳酮、黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、异黄酮、氧杂蒽酮等）评估底物谱（图5）。野生型GinPT5仅能催化5个底物且效率低，而M171I突变体可催化其中31个底物，对异甘草素（6）的转化率高达98.04%，成为迄今报道的底物谱最广的植物异戊烯基转移酶。
图5. GinPT5 M171I突变体底物杂泛性考察。
底物选择性的分子机制
为了阐明控制GinPT5底物选择性的机制，作者模拟了GinPT5/DMAPP/Mg²⁺/5和M171I/DMAPP/Mg²⁺/5的复合物模型。模拟结果表明，野生型酶中M171的侧链与底物5之间存在空间位阻（图6A）。当甲硫氨酸残基被异亮氨酸替换后，更短的侧链消除了位阻并扩大了底物结合口袋，从而使M171I突变体能够催化5的异戊烯基化。随后进一步在#171位点构建了九个侧链长度各异的突变体。结果显示，具有较小侧链的突变体对异甘草素（6）和芹菜素（2）等底物的催化效率显著提高；相反，具有长侧链的突变体几乎完全丧失酶活性（图6B）。这一结果提示，#171位点通过调节结合口袋的大小来控制底物混杂性。
除本研究鉴定的六个PT酶外，作者选取了其他四个物种的八个PT酶进行序列比对。#171位残基表现出相当大的变异性，可能的氨基酸包括M、V、I、L、A、G和N（图6C）。分子模拟表明这些残基均位于活性口袋内，提示它们可能参与底物识别或结合（图6D）。为了探究该位点在不同PT中和不同底物类别中的功能重要性，将等效突变引入同源酶中并评估其活性。结果显示，GinPT4-V167I突变体（对应GinPT5中的#171残基）获得了对芹菜素（2）的催化能力，对2¢-羟基染料木素（5）的转化率提高，但丧失了对异甘草素（6）的活性（图6E）。此外，GinPT6-V171I突变体获得了催化5异戊烯基化的能力。上述结果表明，#171位点可能是一个影响PT底物选择性的保守关键位点。
图6. #171位氨基酸残基影响PT的底物选择性。
异戊烯基黄酮的酶法合成及活性评价
利用6个新鉴定的黄酮PT及工程化获得的突变体M171I，作者建立了可合成14个甘草来源异戊烯基黄酮的生物合成平台，涵盖查耳酮、黄酮、异黄酮、黄酮醇四种结构亚型。其中，化合物1a为一个新化合物，并在胀果甘草根中天然存在但此前未被分离表征。
在LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞NO生成模型中，评价了游离黄酮及其异戊烯基衍生物的抗炎活性。结果显示，几乎所有异戊烯基黄酮均能抑制NO产生，其中1a、5b、6a、8a、9b、11b活性尤为显著。与未异戊烯基化的前体相比，3a、5b、8a、9b、11a、11b的活性显著增强，证明异戊烯基修饰对抗炎活性至关重要（图7）。
图7. 异戊烯基黄酮类化合物的生物合成与抗炎活性。
本研究首次从胀果甘草中系统鉴定了6个黄酮异戊烯基转移酶，包括首个查耳酮C3¢-PT（GinPT3）和黄酮醇C3¢-PT（GinPT6）。通过理性设计获得GinPT5-M171I突变体，其对31个酚类底物具有异戊烯基化活性，是迄今底物谱最广的植物PT。利用这些天然和工程化酶，成功构建了异戊烯基黄酮的多样化生物合成平台，并证实异戊烯基修饰显著增强抗炎活性。该工作不仅丰富了植物异戊烯基转移酶的工具箱，也为异戊烯基黄酮类药物的高效生物制造提供了新策略。
北京大学药学院、天然药物及仿生药物全国重点实验室、北京大学-云南白药国际医学研究中心叶敏教授及团队Co-PI王子龙副研究员为论文的通讯作者。北京大学药学院2021级直博生叶蕾为第一作者。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金项目的支持。
论文链接：https://doi.org/10.1021/acscatal.6c00459
叶敏教授团队合影
