呋喃色原酮是一类重要的活性天然产物，具有抗炎、抗病毒、保肝等多种药理活性。凯林是首个被发现的呋喃色原酮类天然产物，具有呋喃色原酮母核结构以及两个甲氧基取代。1879年，凯林以非纯品形式首次从阿拉伯地区药用植物阿米芹中分离获得。随后在1930-1931年间，凯林被进一步纯化，其结构也得以确认。1990年，凯林曾在德国上市为一种治疗心绞痛的药物。此外，其还具有抗炎、抑菌、抗紫外线和镇痉等药理活性。尽管呋喃色原酮的生物合成途径已经被部分解析，参与凯林生物合成中C-C键断裂和C-8甲氧基取代的生物合成酶尚不明确。
近期，北京大学-云南白药国际医学研究中心副主任叶敏教授团队于ACS Catalysis杂志在线发表题为《Biosynthesis of Khellin, a Prototypical Furochromone》的研究论文。该研究解析了阿米芹中凯林的生物合成途径，并发现阿米芹在根部和花中表达两条识别不同底物的5-O-甲基转移酶参与呋喃色原酮合成。研究发现，AvOMT1中的N272和AvOMT2中的G327分别是识别底物去甲丁香色原酮和维斯阿米醇的关键氨基酸残基。其中，N272仅在AvOMT1中存在，形成了阿米芹特有的色原酮代谢途径。
生物合成途径推测与候选基因挖掘。
结合防风中已报道的呋喃色原酮生物合成途径，研究者推测凯林的生物合成需要III型聚酮合酶（PKS III）、异戊烯基转移酶（PT）、细胞色素P450酶（CYP450）和O-甲基转移酶（OMT）的参与（图1A-B）。通过成分分析，发现凯林（7）及其生物合成前体齿阿米醇（5）在阿米芹花中含量较高（图1C-D）。在此基础上，研究者对阿米芹进行转录组测序与分析，获取花中高表达的III型聚酮合酶、异戊烯基转移酶、细胞色素P450酶和O-甲基转移酶基因用于后续功能表征（图1E）。
图1 凯林的生物合成途径推测与候选基因挖掘。
凯林的生物合成途径解析。
本研究在本氏烟草中对候选基因进行异源表达与功能表征。发现异源表达AvPCS时，烟草叶片能够产生去甲丁香色原酮（2）。依次在农杆菌菌株组合中加入表达AvPT和AvPC的菌株后，能够相继检测到前胡宁（3）和维斯阿米醇（4）。继续表达AvOMT1与AvOMT2则均能产生5-O-甲基维斯阿米醇（4a）。此外，在表达AvOMT1时，还能检测到5-O-甲基去甲丁香色原酮（2a）和5-O-甲基前胡宁（3a），而在表达AvOMT2时无法检测到这两个甲基化产物，由此推测在阿米芹中存在两条合成呋喃色原酮的生物合成途径（途径A，B）（图2A-B）。使用相同的方法，本研究还鉴定了催化4a发生侧链断裂生成齿阿米醇（5）的AvVS，催化5发生8-C-羟基化生成8-去甲凯林（6）的AvV8H和催化6通过8-O-甲基化反应生成凯林（7）的AvOMT3（图2C）。
图2 凯林的生物合成途径解析。
AvOMT1与AvOMT2功能差异的形成原因。
为了探究AvOMT1与AvOMT2参与不同呋喃色原酮生物合成途径的原因，本研究通过大肠杆菌表达和体外酶促反应对这两条O-甲基转移酶的催化功能进行验证。研究发现，AvOMT1仅能识别去甲丁香色原酮（2），而AvOMT2仅能识别维斯阿米醇（4）（图3A-B）。通过结构模拟、分析以及互补突变实验，本研究发现AvOMT1中的N272和AvOMT2中的G327分别为识别底物2和4的关键氨基酸（图3C）。
图3 AvOMT1与AvOMT2的催化功能差异与互补突变。
通过结构分析，研究者认为AvOMT1中的N272在突变为天冬氨酸后，游离的酸根离子可能会与底物2中5-OH的质子产生静电作用，从而吸引5-OH靠近，使其远离O-甲基转移酶中负责脱质子启动反应的H271，进而丧失催化活性（图4A-D）。而对于底物4，AvOMT1中E327可能会与底物中的异丙醇基团形成氢键相互作用，将底物的5-OH拖离反应中心，从而丧失活性（图4E）。为验证这一猜想，研究者使用AvVS酶先去除4的异丙醇基团，再使用AvOMT1和AvOMT2-G327E分别进行下一步催化，生成产物5。而调换反应顺序时则并无该产物生成，进一步说明E327与4中异丙醇基团之间的相互作用阻碍了5-O-甲基化反应的发生（图4E）。
图4 AvOMT1与AvOMT2催化功能差异的形成机制。
途径B在伞形科植物中的独特性与形成原因
在已有研究中，伞形科植物能够通过途径A合成呋喃色原酮，而AvOMT1参与的途径B在伞形科植物中的分布尚不明确。本研究对阿米芹和其他八种伞形科植物进行成分分析，发现途径B的关键中间代谢物2a仅在阿米芹中存在（图5A），由此推测途径B仅在阿米芹中参与色原酮代谢。随后，本研究从所选植物基因组中获取了所有O-甲基转移酶基因，并通过系统发育分析获得了来自不同植物的色原酮5-O-甲基转移酶基因。通过序列比对，发现识别底物2的关键氨基酸N272只在阿米芹的AvOMT1中存在，其他植物的5-O-甲基转移酶在相应位置均为天冬氨酸（图5B），说明N272在阿米芹AvOMT1中的出现可能是导致其形成独特色原酮代谢途径的原因。
图5 阿米芹中色原酮代谢途径B的独特性及形成原因。
综上所述，本研究完整解析了凯林在阿米芹中的生物合成路径，鉴定了8个生物合成酶，包括一个III型聚酮合酶、一个异戊烯基转移酶、三个细胞色素P450酶以及三个O-甲基转移酶。其中，5-O-甲基转移酶AvOMT1与AvOMT2的催化功能差异导致阿米芹中存在两条呋喃色原酮生物合成途径（途径A与途径B）。AvOMT1中N272的独特性是造成阿米芹中存在独特的色原酮代谢途径B的重要原因。该研究为凯林等活性呋喃色原酮的绿色合成提供了工具酶，也为理解植物天然产物生物合成途径的进化机制提供了见解。
原文链接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.6c01695
北京大学药学院天然药物及仿生药物全国重点实验室、北京大学-云南白药国际医学研究中心叶敏教授为论文通讯作者。2020级长学制学生邹建霖、2021级直博生李鸿晔为论文共同第一作者，田华阳博士和王子龙副研究员等做出了重要贡献。该研究工作得到国家重点研发计划的支持。
叶敏教授团队合影
